2023年6月7-8日，瑞沃德特邀達普生物產(chǎn)品經(jīng)理潘鑫和達普生物、高級科學家肖之夏做客直播間，以“單細胞測序:從樣本制備到數(shù)據(jù)挖掘的全流程探討”為主題進行精彩分享，在線與大家一起探討單細胞測序的奧秘！

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6月7日，達普生物產(chǎn)品經(jīng)理潘鑫老師，圍繞“從測序演變探討單細胞測序樣本制備與建庫解決方案”主題進行分享，從測序發(fā)展概述、單細胞測序到樣本制備及建庫重點難點解決進行全面講解。

其中，潘鑫老師為大家分享“達普生物Galaxy系統(tǒng)與瑞沃德單細胞懸液制備儀無縫連接”案例，再次強調瑞沃德與達普生物雙方強強聯(lián)合，攜手推進單細胞測序領域發(fā)展的決心。

6月8日，達普生物、高級科學家肖之夏老師為大家分享“單細胞測序生信分析及數(shù)據(jù)挖掘”的主題內容，詳解生信分析概要、生信報告解讀、生信數(shù)據(jù)挖掘及案例展示以及如何搭建一個好的生信平臺。

其中，肖之夏老師在線仔細解讀“Scaling of scRNA-seq experiments”“scRNA-seq Workflow & Application”“Reads Quality & Mapping Statistics”等等單細胞技術的核心要點及步驟。

答疑精選，問題詳解

在直播答疑互動環(huán)節(jié)，兩場直播在微信視頻號、嗶哩嗶哩等平臺收到很多在線觀眾提問，現(xiàn)將兩場直播聊天區(qū)的問題，精選26個來詳細解答。

聊天區(qū)部分問題詳解

6月7日樣本制備

1. 請問老師微流控芯片最多可以同時處理多少個樣本呢？

答：達普的Galaxy單細胞建庫系統(tǒng)，每張芯片有可以同時處理4個樣本的，也有可以同時處理8個樣本的，且芯片上的每個樣本都是獨立運行，單次可處理1個樣本，不影響芯片下次使用。

2. 請問單細胞測序對樣本有哪些要求呀？

答：單細胞測序要求盡量采用新鮮的組織樣本或血液樣本進行單細胞懸液制備，單細胞懸液制備后要求細胞活性大于85%， 團塊率小于5%，細胞濃度500-1200cell/μL，非細胞雜質占比小于30%。

3. 雙胞率多少？如果會的話后續(xù)結果有影響嗎？

答：通過人鼠混合細胞進行雙包率測序，結果顯示Galaxy 平臺的雙包率為1.1%/3000個，后期數(shù)據(jù)分析的時候可以過濾掉。

4. 利用消化酶解離細胞的時候，會不會影響細胞的表面抗原影響后續(xù)流式分選？

答：在保證細胞活性能滿足建庫要求的前提下，對細胞表面抗原影響較小，酶解是比較經(jīng)典的組織解離方式，一般流式分選前的細胞懸液制備也都是通過這種方式實現(xiàn)，絕大部分樣本效果還是比較好。

5. 神經(jīng)元樣本怎么做單細胞測序？

答：條件允許情況下，應將組織樣品充分灌注后進行解離。神經(jīng)元樣品制備細胞核懸液操作相對簡單，且雜質較少，顆粒參數(shù)更適合單細胞平臺上機。如果能夠制備出滿足平臺上機要求的單細胞懸液，也可以使用單細胞懸液上機，可嘗試使用瑞沃德腦組織解離試劑盒。

具體的操作方法我們也有各地域專業(yè)的技術支持同事根據(jù)不同樣本類型來提供給您一些處理意見。

6. 老師這里講的都是腫瘤相關的，發(fā)育相關的研究單細胞測序怎么做啊？

答：根據(jù)研究需求，取不同發(fā)育階段組織樣本進行單細胞轉錄組測序， 之后構建細胞圖譜，鑒定細胞類群，找到跟發(fā)育相關的生物標志物，通過擬時性分析細胞的發(fā)育軌跡等，分析基因網(wǎng)絡調控等，以揭示細胞發(fā)育的深層機制等。

7. 你好，間充質干細胞進行測序的話怎么處理樣本呢？

答：如果您只想做單純的間充質干細胞測序的話，在制備組織單細胞懸液后，先需要通過流式或磁珠分選的方式富集間充質干細胞，之后再按常規(guī)樣本進行單細胞測序文庫構建，測序及數(shù)據(jù)分析即可。

8. 帶熒光細胞分選要注意什么？

答：細胞熒光對單細胞測序的捕獲和建庫過程沒有影響，可正常進行實驗操作。

9. 外周血樣本如何儲存？

答：準備進行單細胞測序的外周血樣本，需要先分離PBMC之后再收集PBMC加入凍存液進行梯度凍存。

10. 請問，手術組織標本，放RNA-later，凍-80，可以用來單細胞測序嗎？

答：凍存和固定后的細胞不建議進行單細胞測序，加了RNA-later，組織細胞活性會受損，這個試劑主要是固定RNA，方便后面RNA提取，而單細胞測序對細胞活性有比較高的要求，一般來說如果條件允許，盡量別凍存后復蘇做單細胞，之前做過老師凍存的樣本，發(fā)現(xiàn)中位基因數(shù)會低，以及細胞類群相比于新鮮的會有所改變。

11. 請問可不可以做細胞核單細胞測序呢？

答：細胞核的樣本的單細胞測序也是可以兼容的，我們之前嘗試過人鼠細胞系混合樣本提核，效果還不錯。

12. 老師您好，不同測序平臺有什么區(qū)別嗎？我們該如何選擇？

答：對于Galaxy 單細胞建庫系統(tǒng)構建的文庫，在不同測序平臺上的主要區(qū)別是價格不一樣， 所以怎樣選擇主要是看您對測序價格的考慮；Galaxy構建的文庫在不同測序獲得數(shù)據(jù)是高度一致的。

而對于一些其他平臺構建的單細胞測序文庫在不同平臺上測序除了價格上的差異，另外就不同測序平臺測出的基因中位數(shù)可能會有20%左右的差異， 這時選擇就需要綜合數(shù)據(jù)質量和價格雙因素綜合考慮了。

13. 請問老師有推薦的實驗工具或者軟件嗎？ 

答：單細胞測序的整個流程包括包括樣本解離，細胞懸液質檢，文庫構建與質檢，測序及數(shù)據(jù)分析，在組織樣本解離與懸液質檢這部分，可以通過手動酶解方式，也可以通過酶解+自動解離方式，瑞沃德有配套單細胞懸液酶解試劑盒、全自動單細胞懸液制備儀、細胞計數(shù)儀供大家完成單細胞懸液及細胞質檢部分的工作，在單細胞建庫這部分，達普生物有Galaxy 單細胞建庫系統(tǒng)及配套的3’轉錄組試劑供大家適用，并且有配套的生信分析軟件StarScope幫助大家完成從原始數(shù)據(jù)到生信報告的分析，導出的表達矩陣可兼容第三方軟件下游的分析軟件我們推薦使用， 測序可以兼容主流的測序平臺如Novaseq vs T7等。

6月8日 生信分析問題解答

1. 老師您好，有好用的工具或軟件推薦嗎？

答：對于生信數(shù)據(jù)部分，原始數(shù)據(jù)分析可以使用達普自主研發(fā)的StarScope軟件進行分析，獲得表達矩陣后，可以兼容第三方的軟件，下游的分析軟件我們推薦使用：

seurat（網(wǎng)址：https://satijalab.org/seurat/articles/install.html）

scanpy（網(wǎng)址：https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/）

scater（網(wǎng)址：https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/scater.html）

如以人PBMCs為例，細胞鑒定可以借助CellMarker2.0軟件 ；數(shù)據(jù)的整合分析可借助Seurat5 工具；

2. 請問老師有哪些單細胞數(shù)據(jù)庫是比較好用的呢？

答：目前比較好用的數(shù)據(jù)庫有：Panglaodb，Human Protein Atlas等。

3. 如何判斷數(shù)據(jù)的質量是否ok？有固定的某幾個數(shù)據(jù)綜合來看嗎？或者數(shù)據(jù)的值高于某個固定數(shù)值，就能表明數(shù)據(jù)的質量是比較好的？

答：判斷數(shù)據(jù)質量最直觀首先看測序的Q30是否大于90%， 其次看捕獲的細胞數(shù)，細胞捕獲大于45%以上是比較正常，再就基因中位數(shù)，正?；蛑形淮笥?000比較正常，reads Mapping到基因組上的信息是否大于90%，再深入一點就看線粒體基因污染，被檢測到的線粒體基因百分數(shù)，一般細胞有>20%線粒體基因表達的話，被認為是死細胞。

Cell barcode圖的拐點是否明顯，不明顯可能就是細胞碎片比較多。

4. 請問細胞通訊分析的計算方法中，一般是分析系統(tǒng)中根據(jù)不同細胞默認的一個數(shù)值？還是需要根據(jù)經(jīng)驗多次嘗試？

答：Cell-cell communication的分析中較為常用的軟件是cellphoneDB。其input包括normalized過的表達矩陣，每個細胞的細胞類型信息（需要預先進行細胞類型注釋），和cellphoneDB的數(shù)據(jù)庫文件。一般使用默認的參數(shù)就可以適用于大多數(shù)的研究了。

5. 分群的時候T細胞的兩個cluster分的很遠，沒在一起怎么辦？

答：如果是多樣本整合的結果可以先確認下是否是批次效應等原因導致的。T 細胞本身包括兩大類群CD4和CD8，在正常數(shù)據(jù)中就會存在兩個不同的分群。

另外在病人或者是接受了處理的數(shù)據(jù)中，很可能還會已經(jīng)有了免疫細胞的響應，在多樣本整合的結果中還有可能出現(xiàn)多個不同響應的細胞群體，所以是有可能出現(xiàn)不同存在于不同的cluster的。另外UMAP和TSNE中的距離是經(jīng)過特定的換算，并不能代表實際的細胞距離。

6. 老師好，單細胞過濾的時候，有關紅細胞基因是否要過濾？

答：一般單細胞懸液制備的過程中，都會加一個破紅的過程以去除紅細胞，正常情況都不做紅細胞過濾處理。

7. 老師好，想請問下，要拿到像您show的那么漂亮的數(shù)據(jù)，對細胞的要求是怎樣的呀？

答：對細胞的要求是，首先無論組織樣本還是血液樣本，盡量采用新鮮樣本， 細胞懸液活性85%以上，團塊率小于5%， 細胞濃度不低于500-1200cell/μL。

8. 想問一下老師，影響測序深度的因素有哪些呀？

答：影響測序深度主要是組織類型和狀態(tài)，細胞捕獲數(shù)和測序的數(shù)據(jù)量，測序數(shù)據(jù)量越高，測序質量好，測序深度就越高。

9. 孔板法和微流控各自的優(yōu)缺點是什么？應該怎么選擇呢？

答：孔板法的有點是對細胞活性要求相對低一些，缺點是單次運行樣本數(shù)量少，一般1-2個樣本，且每張芯片上微孔數(shù)有限，細胞上樣量相對較低，獲得細胞較少；

微流控的優(yōu)點是單次可同時處理多個樣本，且每個樣本可上數(shù)萬個細胞，細胞捕獲率也比較高，50%以上，需要根據(jù)實驗的需求及樣本情況進行選擇，希望獲得更多細胞樣本的信息可以選擇微流控平臺；對于樣本量少，細胞活性也不好的樣本，可以試試微孔板法，應該也能獲得一部分細胞的信息。   

10. 請問老師測序的數(shù)據(jù)量和捕獲細胞數(shù)對數(shù)據(jù)的結果影響大嗎？

答：不同的測序深度，在達到飽和之前，獲得基因中位數(shù)據(jù)和細胞數(shù)量相差比較大，基因中位數(shù)不同的組織樣本的標準差別較大，一般應該大于1000；捕獲的細胞數(shù)量對不同研究需求有一定的影響，如一些稀有細胞群的鑒定可能會受影響。

11. 請問老師影響捕獲細胞數(shù)量的因素有哪些呀？

答：影響細胞捕獲的因素包括：細胞懸液的質量（活性，細胞碎片、團塊率），投入的細胞數(shù)量及單細胞包裹是否成功，反轉錄建庫試劑盒性能等都會影捕獲的細胞數(shù)量。

12. 3'和5'的基因表達文庫有什么不同嗎？

答：3'和5'的基因表達文庫的不同一個是獲得3'端基因序列，一個是獲得5'端基因序列，5'端主要用于免疫組庫的分析

13. 請問能專門做粒細胞的單細胞測序嗎？

答：由于粒細胞離體后仍然非?；钴S，容易在獲取過程或實驗過程中破碎、死亡，有些研究表明其會向背景中釋放可剪切游離核酸片段的物質，影響測序質量，以上因素導致含粒細胞比例較大的樣本很難得到有效的單細胞測序數(shù)據(jù)，一些多組學實驗中則需要設法去除中性粒細胞。

截至目前，針對粒細胞的高通量單細胞測序尚無高質量的數(shù)據(jù)結果。

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